اندازه گیری گلوکز خون به روش گلوکز اکسیداز

 

بسمه تعالی

نام آزمایش : اندازه گیری گلوکز خون به روش گلوکز اکسیداز

            مقدمه:        

با وجود آن که طبیعت رژیم غذایی بسیار متنوع است و یک انسان طبیعی به طور متناوب در طول روز در وعده های خاصی غذا می خورد و بین وعده ها ودر طول شب را در حالت ناشتا به سر می برد، اما میزان قند خون در یک دامنه محدود حفظ می شود.حتی در شرایطی که فرد برای دوره های طولانی تری از غذا اجتناب می ورزد (همانند زمان روزه داری ) باز هم قند خون بسیار آهسته کاهش می یابد.

گلوکز مهم ترین منبع انرژی برای بدن انسان است ، میزان گلوکز در خون ثابت است و تحت تاثیر شرایطی مثل غذا خوردن یا گرسنگی طولانی مدت ،تغییرات اندکی می کند.تغییراتی که منجر به افزایش یا کاهش میزان گلوکز می شود،اغلب نشانۀ بیماری است.گلوکز از کربوهیدرات های رژیم غذایی تشکیل شده و به صورت گلیکوژن در کبد و عضلات اسکلتی ذخیره می شود.مهم ترین هورمون هایی که قند خون راتنظیم می کنند،انسولین و گلوکاگون هستند.علاوه بر این دو ،هورمون های مترشحه از غده هیپوفیز (مثل هورمون رشد)و قسمت قشری غده فوق کلیه (مثل کورتیزول)و تیروکسین ( یا هورمون تیروئیدی   ) کاتکولامین ها (اپی نفرین و نور اپی نفرین) در این عمل شرکت می نمایند.

بعد از صرف یک وعده غذایی ،قند خون به وسیله کربوهیدرات های رژیم غذایی تامین می شود.کبد،گلوکز را به گلیکوژن و تری گلیسرید تبدیل می کندو عضلات گلوکز را به گلیکوژن تبدیل می کنند(در حالت ناشتا ،کمبود گلوکز خون به وسیله ی تجزیه گلیکوژن ذخیره شده در کبد یا گلیکوژنولیز و بعد گلوکونئوژنز تامین می شود)

بنابراین با خوردن غذا و جذب گلوکز از طریق دستگاه گوارش ،گلوکز از راه سرخرگ باب کبدی وارد کبد می شود.گلوکزی که از کبد عبور کرده و توسط جریان خون محیطی به بافت های محیطی می رود،توسط آن ها و به واسطه انسولین جذب می شود.

انسولین در سلول های بتا جزایر لانگرهانس لوزالمعده ساخته می شود و به گیرنده های انسولین موجود در عضله و سلول های چربی و... متصل می شودو گلوکز را به داخل این سلول های هدف می راند تا به این وسیله سطح گلوکز خون کاهش یابد.بدون انسولین گلوکز نمی تواند به داخل سلول ها وارد شود.به این ترتیب، پس از 1.5 الی 2 ساعت بعد از صرف غذا مجددا مقدار گلوکز خون به محدوده نرمال بر می گردد.بنابراین دلیل کاهش قند خون،جذب گلوکز رژیم غذایی به وسیله بافت ها به ویژه کبد ، بافت چربی و عضلات است.

در فاز ناشتا ، گلوکز خون و انسولین هر دو کاهش یافته اما گلوکاگون افزایش می یابد(گلوکاگون از سلول های آلفا- جزایر لانگرهانس لوزالمعده  ترشح می شود)،این تغییرات هورمونی موجب پیشرفت فرایند های گلیکوژنولیز و گلوکونئوژنز در کبد می شود و به این طرق قند خون حفظ می شود.

      تغییرات فیزیوپاتولوژیک گلوکز خون :

هیپرگلیسمی(Hyperglycemia)  :   زمانی که مقدار گلوکز خون از محدوده نرمال بیشتر شود.

هیپوگلیسمیHypoglycemia))  :    زمانی که مقدار گلوکز خون از محدوده نرمال کمتر شود.

§                     در نوزادان ،شیرخواران و کودکان دستگاه تنظیم کننده قند خون کامل نشده است و تغییرات قند خون این ها را باید متناسب با محدوده نرمال آن ها تفسیر کرد.

مقادیر طبیعی قند خون بالغین  :     70-100  mg/dl

مقادیر طبیعی قند خون نوزادان  :     30-60   mg/dl  

مقادیر طبیعی قند خون شیرخواران  :      40-90  mg/dl 

آستانه کلیوی گلوکز : کلیه ها که به صورت دستگاه تصفیه کننده خون عمل می کنند ،برای بازجذب گلوکز به خون دارای محدودیت می باشند که آستانه کلیوی گلوکز نامیده می شود که این میزان  180  mg/dl است(یعنی ماکزیمم حدی که کلیه گلوکز را جذب مجدد می کند و بیشتر از آن در ادرار دفع می شود)

گلوکز اوری(Glucosiuria) :  اگر مقدار گلوکز خون از این حد بیشتر شود ،گلوکز وارد ادرار شده و دفع می شود.

    علل هیپرگلیسمی(معمول ترین موارد و بیماری هایی که مقدار گلوکز را در مایعات بدن بالا می برند)  :

1.اولیه

-دیابت شیرین وابسته به انسولین (نوع1)

- دیابت شیرین غیروابسته به انسولین (نوع2)

2.ثانویه

-هیپرگلیسمی در نتیجه بیماری های التهابی پانکراس مانندپانکراتیت مزمن

-برداشتن پانکراس(پانکریتکتومی)

-تومور پانکراس

3. هیپرگلیسمی به علت سایر بیماری های شدید اندوکرین

-سندرم کوشینگ(پرکاری قسمت قشری غده فوق کلیه که با افزایش کورتیزول همراه است)

-تیروتوکسیکوز و پرکاری تیروئید

-آکرومگالی و ژیگانتیسم (که با افزایش هورمون رشد و در نتیجه افزایش قند  خون همراه است )

4. هیپرگلیسمی به علت داروها

-استروئیدها                                  -ضد بارداری های خوراکی و....

5. هیپرگلیسمی به علت سایر بیماری های شدید

-نارسایی مزمن کلیه                       -عفونت ها

-بیماری مزمن کبدی

6. هیپرگلیسمی به دلایل گوناگون

-دیابت حاملگی                                         -استرس

-سوختگی ها                                             

   علل هیپوگلیسمی:  ( < 45 mg/dl در بزرگسالان)    

1.                   سوءتغذیه

2.                   هیپوگلیسمی القا شده با دارو مانند   :  -تزریق بیش از حد انسولین در افراد دیابتیک

                                                                          -سولفونیل اوره

                                                                           -فن فورمین

                                                                           -استامینوفن

3.                   بیماری آدیسون(هیپو آدرنالیسم)

4.                   کم کاری تیروئید

5.                   ترشح کم گلوکاگون

6.                   افزایش ترشح انسولین  

      علایم هیپرگلیسمی :  پرنوشی(تشنگی بیش از حد) -پرادراری-تکرر ادراری- گرسنگی بیش از حد

(پرخوری)وکاهش وزن

      علایم هیپوگلیسمی :  عصبی شدن – ضعف-پوست سرد و چسبناک-تعریق مفرط

از نظر پاتولوژیکی ،مهم ترین علت هیپرگلیسمی، بیماری دیابت است و به علت این  افزایش  گلوکز خون خطرناک بوده و می تواند باعث کمای فرد دیابتی شود(شوک هیپر گلیسمی)

     کاربرداندازه گیری تست گلوکز سرم یا پلاسما:

1.                   تایید تشخیص وضعیت پیش دیابت یا دیابت شیرین

2.                   کنترل سطوح گلوکز خون برای افراد دیابتی که یک داروی ضد دیابت (انسولین یا داروی کاهنده قند خون خوراکی ) مصرف می نمایند.

3.                   هیپوگلیسمی در نوزادان

4.                   ارزیابی متابولیسم کربوهیدرات ها در بیماری های مختلف

5.                   سرطان غده پانکراس

تست های آزمایش قند خون:

1.                   گلوکز خون ناشتا(FBS =Fasting Blood Sugar)                                                                       

2.                   قند خون تصادفی(RBS = Random Blood Sugar)                                                                  

3.                   قند خون 2 ساعته(پس از تجویز گلوکز خالص)                       (2h.BS = 2 Hours – Blood Sugar) 

4.                   تست تحمل گلوکز خوراکی(OGGT = Oral Glucose Tolerance Test)                                    

5.                   قند 2 ساعت پس از صرف غذا (2h-PPG = 2 Hours- Post Prandial Glucose)                        

در تشخیص دیابت :

FBS <100                 Nomal

FBS =100-125                   Repeat                      Symptoms + 2h-PP                   Pre Diabetic

FBS 126   ₊ Symptoms                       Diabetic

 2h <140                     Normal

2h=140-199     ₊  Symptoms                    performance GTT

 200 ₊ Symptoms                       Diabetic                

      اندازه گیری گلوکز:

نمونه گیری  :   -فرد باید ناشتا باشد.

نمونه مورد آزمایش  : سرم ،پلاسما،خون کامل و سایر مایعات بدن مانند مایع مغزی نخاعی، مایع جنب  و ادرار

ü                  گلوکز در درجه حرارت اتاق به میزان 7 mg/dl/h متابولیزه می شودو در درجه حرارت 4 درجه سانتی گراد (یخچال)،کاهش آن حدود  2 mg/dl/h می باشد(میزان متابولیسم در صورت آلودگی باکتریایی یا لکوسیتوز بیشتر می باشد)

ü                  گلوکز خون تحت تاثیر گلیکولیز پایین خواهد آمد،در هنگام آزمایش قند خون بایستی از عمل گلیکولیز در نمونه جلوگیری کرد(گلبول های قرمز خون از گلوکز استفاده می کنند ،در فرایند گلیکولیز ،به همین دلیل با زیاد ماندن خون باعث کاهش میزان گلوکز می شوند)به این منظور می توان از 3 روش استفاده نمود:

1.                   جداسازی سریع سلول ها از سرم یا پلاسما با استفاده از سانتریفوژ

2.                   اضافه کردن مهار کننده های گلیکولیز مانند فلوئور سدیم

3.                   سرد نگه داشتن نمونه

    روش های اندازه گیری گلوکز:

1.روش های شیمیایی    

-روش های اکسیداسیون و احیا  :استفاده از محلول مس و یا آهن قلیایی مانند بندیکت – بارفورد

-روش های تراکمی یا Condensation :ترکیبات فنلی یا تغلیظ با آمین های آروماتیک مانند اورتوتولوئیدین

2.روش های آنزیماتیک

Ø                  در بین روش های شیمیایی ،امروزه اورتوتولوئیدین مورد استفاده قرار می گیرد ولی به علت اثر تخریبی معرف آن برروی وسایل و سطوح آزمایشگاه (این آزمایش در شرایط اسیدی و حرارت باعث خوردگی وسایل آزمایشگاه می شود)و نیز سمیت آن (سرطان زا) و نیز غیر اختصاصی بودن آن توصیه نمی گردد،لذا در آزمایشگاه های تشخیص طبی از روش های آنزیمی (گلوکز اکسیداز)استفاده می شود.

Ø                  روش های آنزیمی اختصاصی هستند.امروزه 3 سیستم آنزیمی برای اندازه گیری گلوکز به کار می رود:

1. هگزوکیناز (روش مرجع اندازه گیری گلوکز است ولی خیلی گران است:فقط با گلوکز واکنش می دهد)

2.گلوکز اکسیداز  (به اندازه ی هگزوکیناز حساس نیست ولی ارزان تر است)

3. گلوکزدهیدروژناز

این واکنش ها محصولی را تولید می نمایند که غلظت به دست آمده از آن توسط اسپکتروفوتومتر با غلظت گلوکز متناسب است.

     

روش گلوکز اکسیداز:  آنزیمی – کالریمتری

میزان کینونیمین تشکیل شده  به صورت فوتومتری قابل اندازه گیری می باشدو شدت رنگ ایجاد شده با مقدار گلوکز رابطه مستقیم دارد.

-جذب نور در صورت بیشتر بودن گلوکز زیاد می شودو رنگ بیشتری تولید می شود.

      ریجنت یا معرف گلوکز محتوی:

1.حلال فنل

2.ماده رنگ زا (کروموژن) : 4-آمینوآنتی پیرین(گیرنده کروموژنیک   )اکسیژن را می گیرد وایجاد رنگ می کند.

3.آنزیم های گلوکزاکسیداز-پراکسیداز-گلوکوموتاروتاز

4.بافر فسفات

*آنزیم  گلوکوموتاروتاز جهت تبدیل آلفا-D  گلوکز به بتا - D   گلوکز است.(گلوکز در سرم یا پلاسما 36% به صورت آنومر آلفا و 64% به صورت آنومر بتا است )واکنش گلوکز اکسیداز اساسا روی فرم بتا - D   گلوکز انجام می شود،به همین دلیل ترکیب آنزیمی کیت  آنزیم  گلوکوموتاروتاز را نیز دارا می باشد.

      عوامل مداخله گر با روش گلوکز اکسیدا ز :  میزان بالای اسید آسکوربیک(ویتامین c ) –اوریک اسید-بیلی روبین-کراتینین و... مانع از شرکت H2O2  در واکنش می شوند و از اکسیداسیون جلوگیری می کنند،با این روش مقدار گلوکز به دست آمده از مقدار واقعی آن کمتر است چون این مواد با H2O2  در اتصال با محلول رنگزا  رقابت می کنند.

      محاسبه گلوکز سرم:

Concentration Blood Glucose (mg/dl)=(OD Test / OD Standard)  * Concentration Standard

تهیه و تنظیم:صالحی پور