نام آزمایش : اندازه گیری پروتئین در مایع مغزی نخاعی یا پونکسیون کمری Lumbar puncture(LP) به روش توربیدومتری(کدورت سنجی)

بسمه تعالی

نام آزمایش  :  اندازه گیری پروتئین در مایع مغزی نخاعیCerebrospinal Fluid(CSF)  یا پونکسیون کمری  Lumbar puncture(LP) به روش توربیدومتری(کدورت سنجی)

    مقدمه :

مایع مغزی نخاعی که مایع نخاعی نیز نامیده می شود، در بطن های مغز و در میان طناب نخاعی جریان دارد و به طور کامل مغز و طناب نخاعی را در بر می گیرد و در نتیجه این ساختمان ها را در مقابل صدمات حمایت و محافظت می کند و نیز مانند لنف فرآورده های زائد متابولیسم را حذف می کند. مایع مغزی نخاعی بسیار به آهستگی گردش می کند ، لذا زمان تماس با سلول های سیستم عصبی مرکزی افزایش می یابد.از150-200  میلی لیتر CSF ، تقریبا 100 میلی لیتر به وسیله ی خون در بطن های مغز تولید شده و روزانه به داخل جریان خون بازجذب می شود. مایع مغزی نخاعی عمدتاً به وسیله ی اولترافیلتراسیون پلاسما از دیواره های مویرگی شبکه کوروئید(دسته ای از عروق خونی کوچک) در بطن های جانبی مغز تشکیل می شود. این شبکه همچنین مقادیر جزئی از مواد مانند کلراید را ترشح می کند.

تجزیه و تحلیل مایع نخاع معمولاً شامل  رنگ ، فشار ، شمارش سلول (WBC یا RBC خون ) ، پروتئین ، کلراید و گلوکز می باشد.سطوح پروتئین و گلوکز CSF از سطوح خونی پائین تر هستند ، با این حال ، سطوح کلراید CSF بالاتر از سطح کلراید سرم می باشد. CSFازپالایش پلاسما تشکیل می شود و سومین مایع اصلی بدن است.یک سیستم فیزیولوژیکی جهت تأمین مواد غذایی برای بافت عصبی ، حرکت مواد زاید حاصل از سوخت وساز و ایجاد یک سد مکانیکی برای حمایت مغز و طناب نخاعی از ضربه  و نرم سازی بافت عصبی مهیا می سازد. مقادیر مرجع به ترتیب زیر است:

	رنگ	شمارش سلول (لکوسیت ها)  میکرولیتر	پروتئین(mg/dl)	کلراید(mEq/dl)	گلوکز(mg/dl)
بالغین	بی رنگ و شفاف	0-8	15-45	118-132	40-80
کودکان	بی رنگ و شفاف	0-8	15-45	120-128	35-75
نوزادان نارس		0-20	کمتر از 400
نوزادان	شفاف	0-15	30-200	110-122	20-40
1-6ماهه			30-100

1.        ظاهر   :      مایع نخاع طبیعی شفاف و بیرنگ بوده و میزان چسبندگی آن مانند آب است.

2.      بررسی رنگ   :

I.     گزانتوکرومیXanthochromia

مایع نخاع را سانتریفوژ نموده ، مایع رویی را بررسی می کنیم ، چنانچه به رنگ صورتی ، نارنجی یا زرد باشد آن را گزانتوکروم می نامیم.رنگ زرد نشاندهنده ی خون کهنه (4 الی 5 روز بعد از خونریزی مغزی) است ، مخلوط شدن بیلی روبین وخون ، سطوح پروتئینی بیش از حد بالا ، و تغییر رنگ مایع به طور طبیعی به مدت 3 هفته باقی می ماند.

علل گزانتوکرومی :

1.       ماندن مایع نخاع خون آلود در خارج یخچال به مدت بیش از یک ساعت   :   هموگلوبین تغییر یافته

2.       یرقان     :  وجود بیلی روبین می تواند در زرد شدن CSF نقش داشته باشد.

3.       بالا بودن پروتئین مایع نخاع بیش از 150 میلی گرم در دسی لیتر : غلظت بسیار بالای پروتئین مثلاً به دلیل تومورهای مغزی که گردش CSF را مختل می کند.نمونه های این بیماران به دلیل وجود فیبرینوژن ، بلافاصله لخته می شوند.

4.       رنگدانه های کاروتینوئید، ملانین و ریفامپین

II.   ظاهر ابری

ازدیاد گلبول های سفید (چرک)   :  معمولاً از روی کدورت شدید نمونه مشخص است.وجود سلول های چرکی به وسیله ی میکروسکوپ قابل شناسایی است. ظاهر ابری ممکن است نشان دهنده ی افزایش شمارش WBC یا سطح پروتئین باشد.

III.                 رنگ قرمز روشن

ü      تعیین منشأ خون آلود بودن مایع نخاع :

1.       در خونریزی ناشی از جراحت نمونه برداری به تدریج در لوله های دوم و سوم خون کمتر می شود ونیز در پونکسیون تروماتیک خون CSF لخته خواهد شد.

2.       گزانتوکرومی ، مشاهده میکروسکوپی اریتروفاگوسیتوز و ماکروفاژهای حاوی هموسیدرین نشانگر خونریزی هستند به شرط آن که قبلا جراحت ناشی از نمونه گیری وارد نشده باشد.بعد از جراحت نمونه گیری 1 تا 2 ساعت طول می کشد تا گلبول های قرمز لیز شوند و لذا باید سریعاً نمونه آزمایش شود.در هموراژی زیر عنکبوتیه لخته به وجود نمی آید.

اگر مایع نخاعی به صورت 3 نمونه مجزا گرفته شده باشد ، در حالت خونریزی جدید در فضای زیر عنکبوتیه هر 3 نمونه به طور یکسان به رنگ خون در می آیند ولی در آسیب عروق خونی طی پونکسیون کمری شدت رنگ به طور پیشرونده ای کاهش می یابد . وجود گلبول های قرمز در مایع نخاع رنگ آن را به سمت صورتی یا قرمز سوق می دهد.چنانچه تعداد گلبول های قرمز از 6000 عدد در میکرولیتر بیشتر باشد ، نمای مایع نخاع کاملاً خون آلود جلوه می کند.

3.      کدورت

ü      ایجاد کدورت در Csf می تواند به دلایل ذیل باشد:

1.       معمولاً به دلیل چرک است.

2.       تعدادلکوسیت بیش از 200 عدد در میکرولیتر

3.       تعداد گلبول قرمز بیش از 400 عدد در میکرولیتر

4.       وجود میکروارگانیسم ها (باکتری ، قارچ ، آمیب)

5.       مواد رادیو گرافیک

6.       افزایش پروتئین (مثل مننژیت باکتریایی ، ویروسی ، قارچی و...)

جهت بررسی ظاهر مایع نخاع آن را در برابر نور مستقیم خورشید گرفته با زاویه 90 درجه به آن نگاه کنید . وجود بیش از 50 سلول در میکرولیتر نمایی شبیه به دانه های برف یا ذرات براق در مایع نخاع ایجاد می کند.

4.      لخته شدن سریع

در موارد ذیل ممکن است در مایع نخاع لخته مشاهده شود :

1.       جراحت ناشی از نمونه گیری Traumatic tap

2.       انسدادکامل نخاع(سندرم فریونFroin)

3.       مننژیت چرکی و یا سلی(توبرکلوزی)

4.       وقتی مقادیر زیادی فیبرینوژن در نمونه وجود داشته باشد( که معمولاً با غلظت بسیار بالای پروتئین همراه است) ، لخته ایجاد می شود.

5.       تومورهای CNS

5.      ارزیابی های بیوشیمیایی  :  گلوکز – پروتئین –لاکتات دهیدروژناز – اسیدلاکتیک – گلوتامین -کلراید

   پروتئین

به دلیل این که پروتئین مولکول بزرگی است و از سد خونی مغزی عبورنمی کند مقدار طبیعی آن در CSF بسیار کم است.به دلیل این که آلبومین کوچک تر از گلوبولین است و می تواند راحت تر از سد خونی مغزی عبور کند ، نسبت آلبومین به گلوبولین در CSF  به طور طبیعی بیشتر از پلاسمای خون می باشد. مقدار طبیعی پروتئین مایع نخاع بین 15-45 mg/dl است که در نوزادان تا 150mg/dl و در نوزادان نارس تا 500mg/dl  هم مشاهده می شود.در نوزادان به دلیل نفوذ پذیری نسبتاً بالای عروق ، غلظت پروتئین CSF حدود 3 برابر بزرگسالان است.تعیین پروتئین ، فراوان ترین آزمون شیمیایی است که روی CSF  انجام می شود.

بیماری مغزی می تواند به دو دلیل غلظت توتال پروتئین و نسبت اجزای آن را در CSF تغییر دهد.1)  افزایش نفوذ پذیری عروقی و مننژی می تواند سبب ورود پروتئین بیشتر به CSF شود.     2) ممکن است سلول های التهابی یا سایر سلول های مهاجم ، در کانال مغزی نخاعی پروتئین (ایمنوگلوبولین) سنتز کنند.(افزایش سوخت و ساز سلول های عصبی در پاسخ به حالات پاتولوژیک)

    موارد افزایش پروتئین در مایع نخاع :

1.       پونکسیون تروماتیک نخاعی

2.       افزایش نفوذ پذیری خونی-Csf  :      

                      I.          مننژیت(باکتریایی، ویروسی ، سلی و...)

                      II.           خونریزی یا هموراژی (زیر عنکبوتیه ، داخل مغزی)

                      III.           اختلالات اندوکرین/متابولیک  مانند  کاهش عملکرد اندوکرین ( تیروئید ، پاراتیروئید)

                     IV.          مسمومیت داروئی (اتانول ، فنی توئین )

3.       نقایص جریان csf

I.                 انسدادمکانیکی (تومور مغزی ، آبسه)

II.               تجمعات حفره ای Csf

4.       افزایش ساخت IgG

I.                     نوروسفلیس

5.       افزایش ساخت IgG

6.        و با نفوذ پذیری خونی-Csf

I.                     سندرم گیلن باره

    موارد کاهش پروتئین در مایع نخاع:

1.       برداشت مقدار زیادی از مایع نخاع

2.       نشت مایع نخاع بر اثر ضربه یا نمونه برداری

3.       افزایش فشار داخل جمجمه

4.       هیپرتیروئیدیسم

اندازه گیری پروتئین توتال CSF یک تست نسبتاً غیر حساس برای تشخیص بیماری مغزی است ، زیرا تغییرات غلظت یک پروتئین خاص ، همیشه باعث افزایش قابل کشف در غلظت توتال پروتئین نمی شود.اندازه گیری های سریال را می توان جهت مانیتور کردن درمان به کار برد.

6.      ازریابی میکروسکوپی (هماتولوژیک)  : سیتولوژی  : شمارش کلی و افتراقی سلول ها برای کمک به تشخیص بیماری ها

7.      ارزیابی میکروبیولوژیک  :  رنگ آمیزی لام گرفته شده از CSF  و بررسی میکروسکوپی آن و نیز کشت آن در بررسی مننژیت باکتریایی – نوروسفلیس – مننژیت قارچی و...

8.      ارزیابی سرولوژیک:آزمون های سرولوژیکی بررسی بیماری های التهابی مانندCRP ویا تست VDRL  برای بیماری سفلیس

    شیوه انجام تست :

پس از فراهم کردن لوازم زیر : یک سینی استریل سوراخ کردن کمر ، یک محلول گند زدا(پوویدون آیوداین یا ید ) ، یک ماده ی بی حسی موضعی ( مثلا لیدوکائین) ، یک جفت دستکش استریل و نوار چسب ، بیمار را در وضعیت جنینی قرار داده ، با پشت(کمر) خمیده ، سر خم شده روی سینه و زانو های کشیده  شده به طرف شکم قرار دهید.معمولاً مایع نخاعی به وسیله ی پونکسیون لومبار جمع آوری می شود.به بیمار بگوئید دستان خود را دور زانوان قلاب کند تا بتواند این حالت را حفظ کند.می توان از وضعیت نشسته هم استفاده کرد.

روی سه لوله آزمایش برچسب 1و2و3 بزنید.پزشک فشار مایع نخاعی را با استفاده از یک مانومتر متصل به سوزن بررسی می کند .پزشک جمعاً 10 تا 12 میلی لیتر ( یا 6 میلی لیتر مایع نخاعی  به صورت اجزاء 2 میلی لیتری)مایع نخاعی جمع آوری می کند : 3 میلی لیتر در لوله شماره 1 ،3 میلی لیتر در لوله شماره 2 و 3 میلی لیتر در لوله شماره 3 می ریزد.اولین لوله می تواند آلوده شده باشد ( با خون ناشی از کشیدن مایع نخاع) ونباید برای شمارش سلول ، کشت یا سنجش پروتئین مورد استفاده قرار می گیرد. مایع نخاعی را به  وسیله ی سوراخ نمودن کمر (Spinal tap) که در کیسه ی کمری بین مهره ی کمری 3-4 L یا بین مهره ی کمری 4-5 L انجام می شود به دست می آورند.در ابتدا فشار CSF را اندازه گیری می کنند.سپس مایع را آسپیره کرده و در لوله های آزمایش استریل می ریزند.ابتدا برای آزمایشات میکروبیولوژیک فرستاده می شود و در صورت لزوم بقیه نمونه برای آنالیز شیمیایی قابل استفاده است.اگر تست ها به ترتیب عکس انجام شوند احتمال آلودگی باکتریال نمونه وجود دارد.

لوله شماره 1 برای آزمایش های بیوشیمیایی و سرولوژیکی ، لوله شماره 2 برای میکروب شناسی و لوله شماره 3 برای شمارش سلولی به کار می رود زیرا احتمال کمی وجود دارد که سلول های حصل از پونکسیون مایع نخاعی وارد لوله شماره 3 شوند.

 روش های اندازه گیری پروتئین CSF : 

از روش های متداول اندازه گیری پروتئین ، می توان به  توربیدومتری  - کالریمتری اشاره کرد.

برای اندازه گیری فراکسیون های پروتئین CSF از قبیل آلبومین و گلوبولین الکتروفورز و ایمنودیفیوژن شعاعی(RID) و نفلومتری استفاده می شود.

1.       روش های کدورت سنجی :

استفاده از معرف های اسید سولفوسالیسیلیک و تری کلرواستیک اسید  و سولفات سدیم برای رسوب پروتئین در اندازه گیری پروتئین مایع نخاع معمول است که هر دو دارای محدودیت هایی می باشند.سولفوسالیسیلیک اسید 1.5  %  باعث دناتوره کردن پروتئین های Csf و کدورت نمونه می شود که به وسیله ی اسپکتروفوتومتری قابل اندازه گیری است.

برای اندازه گیری مقدار آن روش بیوره دقیق نیست ، جون مقدار پروتئین خیلی کم است  و روش فولین سیوکالتو هم مناسب نیست چون مقدار آمینواسید های Csf به نسبت برای این روش زیاد بوده و جواب آزمایش دقیق به دست نمی آید.از طرف دیگر افزایش پروتئین Csf در اغلب بیماری ها با افزایش دو جزء مهم پروتئین یعنی آلبومین و گلوبین است ، لذا در بیشتر آزمایشات مقدار گلوبولین را اندازه گیری می کنند به جای پروتئین تام Csf .

2.       روش های رنگ سنجی :

شامل روش لوری ، روش های متصل به رنگ ( که از کوماسی بریلیانت بلو یا پانسوs استفاده می کنند ) ، و روش بیوره تعدیل یافته ، می باشد.روش کوماسی بریلیانت بلو نسبتاً شایع است زیرا سریع و خیلی حساس بوده و با مقادیر کم نمونه قابل انجام است.

      روش آزمایش  :  اندازه گیری پروتئین تام مایع نخاع  :  طریقه ی کدورتی

0.5ml Csf را با 4/5 میلی لیتر اسید سولفوسالیسیلیک 1/5 درصد مخلوط نموده ، به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه نمائید و در مقابل بلانک آب مقطر در طول موج 525 نانومتر بخوانید.

       محاسبه در طول موج 525 نانومتر :

                                 100  *   1.7 * OD     = مقدار پروتئین بر اساس mg/dl